引言

【研究意義】菊花（Chrysanthemum×morifoliumRamat.）是中國傳統名花，深受人們的喜愛。在世界范圍內，菊花是市場上主要的鮮切花之一，也是重要的盆花、地被花卉。菊花起源于中國，是菊屬部分野生種天然雜交再經人工選育形成的，其主要親本為毛華菊（C.vestitum Hemsl.）、野菊（C.indicum L.）與紫花野菊（C.zawadskii Herb.）等，經過長期天然雜交、人工選擇和培育，產生了大量的種下變異，具有豐富的遺傳多樣性。菊花的表型性狀大部分是數量性狀，變異極其豐富，因其極易受環境因素的影響，多年來對菊花復雜性狀的研究始終極為困難。對菊花重要表型性狀的基因型進行解析，尋找與目標性狀相關的分子標記，將為復雜數量性狀的遺傳學研究、品種鑒定及品種保護和分子標記輔助育種奠定重要基礎?！厩叭搜芯窟M展】分子標記技術已成功應用于菊花的起源研究、品種鑒定和遺傳多樣性分析等領域。隨著分子標記技術的發展，利用全基因組的分子標記和合適的分離群體尋找連鎖標記、開展遺傳連鎖作圖是目前植物數量性狀研究的主要方法之一。菊花長期進行無性繁殖，基因組高度雜合，且存在近交衰退現象，所以，菊花的遺傳圖譜構建一直是個難題，在此方面的研究工作剛剛起步。趙婧媛等利用地被菊和盆栽小菊的雜交 F1代群體，通過集團分離分析（bulked segregant analysis，BSA）法尋找到與菊花匍匐性顯著相關的 RAPD 標記。Zhang 等根據“雙-假測交”作圖策略，利用兩個高度雜合的菊花品種作為親本，將其雜交 F1代作為作圖群體，使用RAPD、ISSR、AFLP 和 SRAP 等分子標記成功構建了雙親的遺傳連鎖圖譜，并篩選出與菊花初花期和開花持續期相關的 SRAP 標記，還對花徑、舌狀花數等花器性狀進行了數量性狀位點（quantitative trait loci，QTL）定位。盡管部分連鎖圖已經在菊花中建立起來，但是標記密度較低、連鎖群不完整，制約了其應用潛力?！颈狙芯壳腥朦c】關聯分析，又稱關聯作圖或連鎖不平衡作圖，曾廣泛用于人類遺傳學研究，是一種研究復雜數量性狀的遺傳學方法。它是以自然群體為研究對象，以長期重組后保留下來的等位基因（位點）間連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）為基礎，將目標表型性狀的多樣性與基因（位點）的多態性結合起來分析，可直接鑒定出與表型變異密切相關且具有特定功能的基因位點或標記位點。與傳統的連鎖作圖相比，關聯分析有以下優點：以自然群體為材料，無需構建作圖群體；可以同時檢測同一座位的多個等位基因，而連鎖作圖只能涉及來自親本的2 個等位基因；廣泛的遺傳材料可同時考察多個性狀的大多數 QTL 的關聯位點及其等位變異，不受連鎖作圖中兩親本范圍及群體分離情況的限制。鑒于利用連鎖作圖開展菊花園藝性狀 QTL 定位的難度大、周期長，因此可以考慮利用關聯分析的特點，充分發揮中國菊花種質資源豐富多樣的優勢，以自然群體為基礎開展關聯分析，鑒定與重要表型性狀關聯的分子標記，從而為菊花分子輔助育種服務?！緮M解決的關鍵問題】本研究在分析群體結構的基礎上，用關聯分析對 58 個大菊品種的 18 個數量性狀與 SRAP 分子標記進行關聯，希望鑒定出與上述性狀相關聯的標記位點，為菊花育種工作的深入開展和品種鑒定提供一些有價值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所有材料均來自北京林業大學菊花資源圃。在 2008—2010 連續 3 年對菊花資源圃內 800余個大菊品種表型性狀進行觀測分析的基礎上，以盡可能覆蓋大菊品種出現的所有性狀變異為原則，在資源圃中選擇具有代表性的 58 個大菊品種（涵蓋 5 個瓣型，30 個花型；包括 50 個中國品種和 8個日本品種），為無直接親緣關系的自然群體（表1）。

所有品種于 5 月在日光溫室中扦插繁殖，6—7 月定植于直徑 30 cm 瓦盆中，按照獨本菊的栽培技法常規田間管理。

1.2 方法

1.2.1 表型性狀的測定與分析 本研究中測定 18 個數量性狀，包括：花部性狀 11 個（花徑大小、花瓣長度、花瓣寬度、花梗長度、花高、花梗粗度、舌狀小花數、筒狀小花數、筒狀花長度、筒狀花部直徑、花托大?。?；葉部性狀 4 個（葉柄長度、葉片長度、葉片寬度、葉厚）；莖部性狀 2 個（節間長度、莖粗）；整體性狀 1 個（植株高度）。性狀的測定方法參照雒新艷等的描述。每個品種測量 10 個單株，取平均值。計算各性狀在品種內和品種間的變異系數，計算公式為：CV=S/X，S={[EX2-\\(EX\\)2/N]/N-1}1/2其中，CV 為變異系數，S 為標準差，X 為樣本均值。

1.2.2 DNA 提取 田間取植株嫩葉，用改良 CTAB 法提取基因組 DNA。用 1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定 DNA 質量和濃度，并將濃度稀釋至 50ng·μL-1，樣品在-20℃下保存備用。

1.2.3 SRAP 分析 選用正向引物 13 條，反向引物 10條，共 130 對 SRAP 引物用于引物篩選。SRAP 分析參照張飛等的方法，經過體系優化及引物篩選后，對供試品種進行擴增。將具有相同遷移率的擴增片段，按照二進制方法進行記錄，即有帶的記為 1，無帶的記為 0，僅記錄清晰、穩定的擴增條帶，最終形成 0/1矩陣輸入計算機。遺傳多樣性分析采用多態性信息量（Polymorphism Information Content，PIC）指標。按照 Anderson 等的計算方法，標記 i 的 PIC 值計算公式為：【1】

其中，pij表示標記 i 第 j 種帶型出現的頻率，標記 i的帶型數從 1 到 n。PIC 值的范圍為 0—1，0 表示無多態性，1 表示具有非常高的多態性。

1.2.4 數 據 統 計 與 分 析 群 體 結 構 分 析 用STRUCTURE軟件對菊花品種群體結構進行基于數學模型的類群劃分。先設定群體數目（K）為 2—9，將 MCMC（Markov chain Monte Carlo）開始時的不作數迭代（Length of burn-in period）設為 10 000 次，再將不作迭代后的 MCMC 設為 100 000 次，然后計算出每個 K 值對應的 lnP（D）值，根據似然值最大的原則，選擇合適的K值，并計算得到每個品種相應的Q值（第i 品種其基因組變異源于第 k 群體的概率）。關聯分析應用 TASSEL 軟件 GLM（General Linear Model，一般線性模型）程序，將各個菊花品種的 Q 值作為協變量，將18個數量性狀的表型性狀數據分別對SRAP標記變異逐一進行回歸分析，確認表型性狀關聯位點并計算位點對表型變異的解釋率。GLM 回歸方程是:【2】

其中，Aj是第 j 個材料數量性狀測定值，β 是群體各位點各等位變異的平均效應，Cpj是第 j 材料第 P 等位變異出現的指示變量，B1j—Bkj是第 j 個材料基因組變異源于第 l—k 群體的概率 Q 值，β1—βk是亞群體各位點各等位變異的平均效應，ε 是殘差。

2 結果

2.1 數量性狀的變異分析

本研究中應用變異系數來表示觀測的數量性狀在品種內和品種間的離散性程度。品種內變異系數反映了性狀在同一品種內的穩定程度，品種間變異系數反映了性狀在不同品種間的離散情況。由各性狀變異系數計算結果（表 2）可知，18 個數量性狀在品種內穩定性較好，花梗長度品種內變異系數最高，為 0.22，其余均未超過 0.2，均值為 0.13；花部性狀的品種間變異系數較大，而葉部、莖部等性狀在品種間的差異不如花部性狀明顯。因此，在關聯分析中可能更容易在不同基因型間找到與花部性狀關聯的標記。

2.2 SRAP 分析在 130 對 SRAP 引物組合中篩選出 19 對條帶清晰穩定的引物組合對所選擇的 58 個大菊品種進行擴增，共產生擴增片段 283 條，其中多態性片段為 225條，多態性位點占 80%。每對引物組合檢測等位基因數為 7—23 個，平均為 11.84 個（表 3）。多態性信息量 PIC 值在 0.76—0.94，平均為 0.87，為高度多態性座位，說明選擇的大菊品種群體的遺傳差異非常大，具有豐富的遺傳多樣性，這有利于在關聯分析中發現與表型性狀關聯的位點。圖 1 是引物 Me1/Em6 在供試品種中擴增產物的 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

2.3 供試品種的群體結構分析

利用 SRAP 標記，基于數學模型的群體結構分析表明，樣本的等位變異頻率特征類型數 K=5（即服從Hardy-Weinberg 平衡的亞群數目為 5）時，其模型的后驗概率[lnP\\(D\\)]最大（圖 2）。由此判斷 58 個大菊品種群體可被分為 5 個亞群。依據上述推測的 K 值繪制供試品種群體結構圖（圖 3）。從群體結構圖可以看出，58 個大菊品種中存在 5 個亞群。分析各亞群的生物學意義，發現菊花品種劃分與瓣型和地域相關，可基本被識別為平瓣類、管瓣類、畸瓣類、桂瓣類和日本品種亞群。各亞群存在明顯的差異，具有一定獨立性，這說明供試群體存在著明顯的群體結構。日本品種亞群獨立性最強，而桂瓣類亞群與平瓣類、管瓣類、日本品種亞群基因間滲透性最高；管瓣類亞群與平瓣類亞群有一定滲透性。

為避免群體結構的存在通過影響位點 LD 進而影響關聯分析的準確性，本研究將各品種 Q 值（各品種個體歸入各亞群的概率）作為協變量納入 SRAP 標記與表型性狀變異的回歸分析中。

2.4 SRAP 標記與表型性狀的回歸關聯分析

將58個大菊品種各品種相應的Q值作為協變量，將18個數量性狀的表型變異對SRAP標記變異進行回歸分析，尋找與性狀相關聯的標記及其等位變異。結果顯示，在所檢測的 225 個 SRAP 標記位點中，共有6 個 SRAP 標記位點與 5 個數量性狀（莖粗度、葉厚度、花梗粗度、花瓣寬度和筒狀小花數量）在 P＜0.01水平上相關。與花部性狀（花梗粗度、花瓣寬度和筒狀小花數量）相關位點共 5 個，與莖部（莖粗度）、葉部性狀（葉厚度）相關位點各 1 個，其中位點Me1/Em9-10 同時與莖粗度、花梗粗度相關。各位點對表型變異的解釋率在 0.0738—0.4791，解釋率最大（0.4791）的 SRAP 位點是 Me3/Em7-10，與葉厚度相關，而解釋率最?。?.0738）的位點是 Me1/Em9-10，與莖粗度相關（表 4）?！颈?】

3 討論

3.1 基于數學模型的菊花群體結構分析

利用 SRAP 標記，使用 STRUCTURE 軟件對供試菊花種質進行的基于數學模型的類群劃分，與筆者基于遺傳距離的 SRAP 標記 UPGMA 聚類結果（未列出）基本一致。發現中國大菊品種可分為平瓣類、管瓣類、畸瓣類和桂瓣類 4 個亞群結構，各亞群結構存在廣泛的基因交流，匙瓣類品種并未單獨形成亞群，而是分散在平瓣類和管瓣類亞群內，說明匙瓣類品種在演化關系中是處于平瓣類和管瓣類之間的過渡狀態，這與張樹林提出的不把匙瓣作為單獨瓣型的觀點相一致。盡管所選日本品種多為平瓣類和管瓣類，但并未與中國大菊的平瓣類與管瓣類聚為一群，而是單獨聚為 1 個亞群，說明可能由于地理隔離的因素，其種質來源與演化過程與中國品種相比有一定的差異；但其與各亞群也都存在基因交流，表明日本品種和中國品種在菊花的栽培育種史上存在廣泛的種質滲透現象。

本研究利用 SRAP 基于數學模型的菊花群體結構分析與前人利用形態學數據或其它分子標記基于遺傳距離的聚類方法得到的結果基本一致，證明其可有效對菊花群體結構進行判斷和劃分。相比基于遺傳距離的聚類方法，利用數學模型來分析群體結構可排除亞群劃分的人為因素，更精確地確定亞群數目，并且可更清晰地觀察各亞群間的基因交流情況。

3.2 與表型性狀關聯的分子標記位點

在植物中首次進行全基因組關聯分析的是 Hansen等對野生甜菜生長習性的研究，發現 17 個引物組合擴增的 440 個全基因組范圍內的 AFLP 標記中，有2 個與控制抽薹前是否需要春化的 B 基因顯著關聯。

Kraakman 等對236個AFLP標記和春大麥品種的產量及產量穩定性進行了關聯分析，分別發現 8 個和 5個 AFLP 標記與產量和產量穩定性相關聯。何靜等應用SRAP和EST-SSR分子標記對木薯品種農藝性狀進行關聯分析，在 1471 個 SRAP 標記位點中共檢測到73 個位點與 21 個農藝性狀相關聯，其中 46 個 SRAP標記位點同時與多個性狀相關聯；在 993 個 EST-SSR標記位點中有 20 個位點與 20 個性狀變異相關。本研究在 225 個 SRAP 標記位點中共檢測到 6 個位點與大菊品種 5 個數量性狀相關（P＜0.01），與數量性狀相關聯的 SRAP 位點較少，可能是由于 SRAP標記數量較少造成。嚴格意義上講，全基因組關聯分析需要成千上萬的標記以及盡可能多的無親緣關系的個體。即使是基因組很小的擬南芥，也需要檢測 2 000個分子標記。本研究在 18 個數量性狀中只找到 5個有標記與之關聯的性狀，除了標記數量較少外，供試群體的大小也是影響因素之一。本研究選擇的菊花品種群體較小，每個瓣型的代表性品種約 10 個，每個花型的代表性品種約 2 個，因此在表型性狀多樣性分析中可能并未完全覆蓋各個性狀的全部變異，SRAP標記檢測到的變異位點也十分有限。因此本研究只能算粗略意義上的全基因組關聯分析，在進一步的關聯分析研究中還需增加標記密度，增大群體規模。

本研究所找到的關聯位點中，與花部性狀顯著相關 SRAP 位點共 5 個，而與莖部、葉部性狀相關位點各 1 個，這可能與花部性狀在品種間存在較大程度變異有關，更利于關聯標記的發現。位點 Me1/Em9-10同時與莖粗度、花梗粗度相關。與花梗粗度相關的位點有 2 個，分別是 Me1/Em9-10 和 Me3/Em5-9，與花瓣寬度相關的位點有 2 個，分別是 Me1/Em6-8 和Me5/Em8-5。在中國大菊中，最為困擾育種者的難題之一就是由于花梗纖細造成花頭易折，需要綁扎，耗費人力物力。本研究發現與花梗粗度相關聯的位點 2個，這為大菊育種中培育粗壯品種提供了依據。

目前應用于植物關聯分析的分子標記主要是 SSR和 SNP 標記，本研究應用的是 SRAP 分子標記。SRAP標記位點的多態性比 SSR 或 EST-SSR 高，并結合了RAPD 和 AFLP 的優點，引物的多態性可能由于包含了內含子、啟動子和間隔序列在品種間的變異而產生，具有簡便、穩定、高通量等特點。但是 SRAP 應用于關聯分析也存在缺點：SRAP 標記是顯性標記，不能區分純合顯性和雜合顯性；不能直接獲得位點大小信息，需要根據 marker 片段估測，增大了位點統計誤差。因此在以后的菊花關聯分析中增加 SSR（或EST-SSR）、SNP 等共顯性分子標記是研究的趨勢，而菊花中尚未開發出這兩類標記。鑒于目前菊花基因組的研究水平，利用各種方法開發出菊花的 SSR 標記是目前迫切并且可行的研究任務。

3.3 菊花的關聯分析與連鎖作圖

家系連鎖作圖（Family-based mapping，FBLmapping）與關聯分析是解析植物重要數量性狀基因型的主要方法。本研究利用關聯分析的方法通過回歸分析檢測菊花品種表型變異和 SRAP 位點等位變異的關聯性。在缺乏高密度菊花分子遺傳連鎖圖譜的情況下，利用自然群體開展 QTL 分析，無疑是一種較簡便且有效的方法。研究表明，利用關聯分析檢測到的分子標記位點，大多與定位于遺傳連鎖圖上的 QTL 位點相一致。但關聯分析的缺陷是不能估計 QTL 的具體位置及其加性或上位性效應。如果關聯分析和連鎖作圖相結合，將大大促進復雜數量性狀的剖析，有助于更準確、更精確地鑒定出控制菊花重要園藝性狀的 QTL位點。

4 結論

本研究是首次在菊花品種中開展利用自然群體的關聯分析。使用篩選出的 19 對 SRAP 引物組合對 58個典型大菊品種進行多位點掃描分析。在對供試材料進行基于數學模型的群體結構分析的基礎上，將菊花18 個重要表型性狀數據分別對 SRAP 標記變異進行回歸分析。檢測到 5 個數量性狀與 6 個 SRAP 標記位點相關聯，獲得了與莖粗度、葉厚度、花梗粗度、花瓣寬度和筒狀小花數量關聯的標記位點。本研究證明基于數學模型的群體結構分析可有效對菊花群體結構進行判斷和劃分，也為大菊品種分類提供了新的手段；關聯分析為菊花復雜的數量性狀解析提供了新的途徑，能夠有效地找到與菊花表型性狀關聯的 SRAP 標記。研究結果可為菊花新品種選育、分子標記輔助育種和控制優異性狀的相關基因的克隆奠定基礎。

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