引言
氣孔作為植物與外界環境進行氣體交換（主要是CO2和H2O）的重要通道，在調節植物光合作用、蒸騰作用以及水分利用中扮演 著 至 關 重 要 的 角色[1].近年來通過研究氣孔發育異常的突變體，發現了許多調控氣孔發育的基因，因此對氣孔發育基本遺傳途徑的認識越來越清晰。植物氣孔發育受到多種環境因素影響，如二氧化碳和水蒸氣，而研究表明一氧化氮（nitric oxide,NO）作為廣泛分布于生物體內的活性小分子，參與了植物生長發育的許多過程[2].那么NO是否也能影響植物氣孔發育，目前還沒有相關報道，為了探究NO在氣孔發育過程中的功能，本實驗利用外源NO處理，以及NO含量變化突變 體，證 明NO調 節 擬 南 芥 氣 孔 發 育 過 程，qRT-PCR結果表明，NO影響氣孔發育相關基因MUTE、SCRM及SCRM2的表達。本結果為植物氣孔發育的調控提供了新的證據，對于改良植物的抗旱性具有重要的理論價值。
1 材料與方法
1.1材料及處理方法
實 驗 所 用 野 生 型 擬 南 芥 （Arabidopsisthaliana L.）為Columbia-0生態型，擬南芥突變體nox1（CS3156）和noa1（CS6511）均購于擬南芥信息資源庫（The Arabidopsis Information Resource）擬南 芥 種 子 經 過 消 毒 液 （5% NaClO和0.01%Triton X-100）消毒5min后，無菌水清洗3次，4℃春化3d后播種于含1%蔗糖和0.8%瓊脂的1/2MS培養基（pH 5.8）。
外源SNP處理時，先將種子在1/2MS培養基中萌發1d,然后移至提前添加不同濃度SNP的1/2MS培養基中，SNP濃度分別為0、10、20、30和40μmol·L-1.以上材料均置于擬南芥培養箱中，培養溫度為22℃,光周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為100μmol·m-2·s-1,濕度為80%~90%.
1.2實驗方法
1.2.1顯微技術取新鮮葉片投入脫色液（V乙醇 ∶V乙酸 =19∶1）中脫色1h,再將脫去葉綠素的葉片浸入透明劑中透明1h,然后用Olympus BX60微分干涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope,DIC）照相。透明劑配方為：水合氯醛80g,甘油10mL,用水定容至100mL.
1.2.2氣孔相關參數統計野生 型WT,突 變 體nox1（CS3156）和noa1（CS6511）三個株系分別隨機選擇十株七天的幼苗，觀察統計幼苗子葉下表皮的氣孔指數（stomatal in-dex,SI）和%（GMC+M）。拍照時每個子葉拍攝兩個不重疊、避開葉脈和葉邊緣的圖片，借助ImageJ軟件來統計SI和%（GMC+M），實驗重復3次。
擬南芥的氣孔發育要經歷三種不同的前體細胞：擬分生組織母細胞（MMC）、擬分生組織細胞（M）和保衛母細胞（GMC）[3],為了更全面準確地分析氣孔發育過程，一般將SI和%（GMC+M）作為衡量氣孔發育 的 指 標。
SI=氣 孔 數/（氣 孔 數+表 皮 細 胞數）；%（GMC+M）=（保衛母細胞數+分生組織細胞數）/（保衛母細胞數+分生組織細胞數+氣孔數+表皮細胞數）[4].實驗數據用Microsoft Excel 2003軟件進行處理，采用Origin 8軟件作圖，本文中所有統計作圖中Error bars代 表 標 準 誤 差 均 值。星 號 代 表 通 過student t test計算出的差異的顯著性程度（*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001）。
1.2.3 RNA提取和qRT-PCRRNA提?。河肨rizol（Invitrogen）提取生長七天幼苗的子葉RNA,每個株系選取100株幼苗，實驗 重復3次，具體步驟如下：液氮研磨幼苗，加入1mL的Trizol,劇烈震蕩15s,室溫靜置5min后移至冰上，4℃，12 000rpm,15min離心后取上層紅色液體于新的EP管中，之后加入200μL氯仿震蕩15s,室溫靜置2min.4 ℃，12 000rpm,15min離心后取上清于新的EP管中，加入500μL異丙醇，室溫靜置30min后再次4℃，12 000rpm,15min離心，吸去管中液體，留管底白色沉淀，用70%乙醇吹打沉淀使其懸浮，4 ℃，7 500rpm,5min離心后吸去乙醇，將EP管置于超凈臺干燥，最后加入20μLDEPC H2O溶解沉淀。
