引 言
鳥類鳴唱是一種復雜的發聲行為，需要感知和運動技能學習等神經過程的參與。與人類語言學習的過程相似，鳥類鳴唱學習過程由腦中的一整套神經結構所控制，我們稱之為鳴唱控制系統[1]。該系統由發聲運動通路 \\(vocal motor pathway，VMP\\) 和前端腦通路\\(anterior forebrain pathway，AFP\\) 構成。VMP 直接對鳴唱行為進行調節，其由端腦高級發聲中樞\\(high vocal center，HVC\\) 發出神經纖維投射至弓狀皮質櫟核 \\(robust nucleus ofthe arcopallium，RA\\)，再由 RA 經腦干舌下神經氣管鳴管亞核 \\(the tracheosyringeal part ofhypoglossal nucleus，nXIIts\\) 支配鳴肌以控制鳴唱行為。HVC 腹側殼區接受前腦聽區的聽覺信息傳入，并通過其中的HVCX投射神經元與 AFP 相聯系。AFP 由 X 區 \\(類似于哺乳類的基底神經節\\)、丘腦背外側核內側部\\(medial portion of the dorsolateral nucleus of theanterior thalamus，DLM\\) 和新紋狀體前部巨細胞核外側部 \\(lateral part of the magnocellularnucleus of the anterior neostriatum，LMAN\\)構成環路，其相當于哺乳類的丘腦-皮層-基底神經節通路，在幼鳥鳴唱學習和鳴曲定型后的維持過程中起關鍵作用。AFP 與 VMP 之間，除了X 區接受 HVCX投射神經元的纖維投射外，LMAN 也向 RA 發出纖維投射，使兩條通路緊密相連\\(圖1\\)。上世紀 60 年代開始，對鳥類鳴唱學習行為的研究逐漸開展起來，尤其在1984 年發現成年鳴禽 HVC 中存在新生神經元之后，引起了神經科學界的廣泛關注，同時更將該領域的研究推向縱深。目前，鳥類鳴唱控制系統已成為學習記憶研究領域的重要模型，對其深入研究可為我們透視腦與行為的關系帶來重大啟示，并為解決帕金森病、急慢性中樞神經系統損傷等神經系統疾病提供重要理論依據。
在許多種類的鳴禽中，鳴唱通常是雄性相關行為，雄鳥通過鳴唱進行求偶。鳴唱控制核團呈現明顯的性別二態性，即在雄鳥中更大也更明顯[4]。研究表明，腦源性神經營養因子\\(brain-derived neurotrophic factor，BDNF\\) 在鳴唱控制系統對鳴唱行為的調控中起關鍵作用。BDNF 是一種重要的神經營養因子，其在神經系統發育過程中起重要作用，并且是神經系統功能的重要調節劑。BDNF 對神經細胞的增殖、再生、分化、生長、存活、電生理活動、遞質傳遞乃至突觸可塑性等均有重要影響，并參與對學習記憶等神經過程的調控。
本文對 BDNF 在鳥類鳴唱學習記憶中作用的研究概況及進展進行了詳細論述。
BDNF 及其受體在鳴唱控制系統內的表達分布BDNF 在鳴唱控制系統內的表達分布在 4000 多種鳴禽中，斑胸草雀 \\(zebra finch\\) 因其外形、鳴唱行為及鳴唱相關神經結構具有典型的性別二態性，被世界各國廣泛用于有關鳥類鳴唱的神經生物學研究。已有研究表明，BDNF 在鳴唱控制系統及鳴唱行為性別二態性的形成中起重要作用。為弄清 BDNF在鳴唱控制系統內的作用時間和位點，Tang等對兩性斑胸草雀鳴唱控制核團內BDNF的表達情況進行了詳細研究。
研究涉及幼鳥發育的四個時期\\(孵化后第25、35、45和65天\\)及成年期。研究表明，雄鳥 HVC 和 RA 中的 BDNF 免疫陽性細胞數量顯著多于雌鳥。與雌鳥孵化25 天后 HVC 中 BDNF 標記逐漸減少的情況 \\(孵化后 35 天僅見零星標記\\) 相比，雄鳥孵化后25～45 天，HVC 中的 BDNF 免疫陽性細胞數量穩定，而 45 天后至成年期，其數量明顯增加。該時間段恰是感覺運動整合的后期，提示 BDNF 在鳴曲的形成過程中可能起重要作用。另外，雄鳥 HVC 中 BDNF 與 proBDNF 的比值在成年后顯著高于發育期。HVC中proBDNF 的含量在發育期和成年后相似，而成年后 BDNF 含量顯著提高。proBDNF 是BDNF的前體，由其裂解生成BDNF。proBDNF在腦中的作用恰與BDNF相反，其通過與p75泛神經營養因子受體\\(p75 pan-neurotrophin receptor，p75NTR\\)結合，促進細胞死亡，并抑制神經元遷徙[7]。BDNF 和 proBDNF 的相對表達受神經活動調節。有報道顯示，高頻刺激可增加大鼠海馬細胞BDNF的分泌，而低頻刺激則增加proBDNF的分泌。對于斑胸草雀，BDNF與proBDNF的比值隨發育期的變化僅見于雄鳥HVC中。
因此，這種BDNF與proBDNF比值的特異性增加，可能由鳴唱行為引起的HVC神經元活動所導致，也許在鳴曲形成及HVC結構變化的過程中起重要作用。在RA中，雄鳥BDNF免疫陽性細胞數量在發育期穩定增加，孵化后65天達到峰值，之后至成年期有所下降。而雌鳥RA內的BDNF免疫陽性細胞則隨著發育逐漸減少。在LMAN和X區，雄鳥孵化后25天直至成年期，BDNF的表達水平相對穩定。
雌鳥LMAN內的 BDNF 標記細胞僅見于孵化后第 25 天組，而 X 區內各期均未見 BDNF 標記。另有研究結果顯示，孵化后 20 天，BDNF 的表達僅見于雄鳥 HVC。孵化后 45 天，HVC 中 BDNF的表達量達最高，同時，HVC 至 RA 的投射纖維及 RA 中也可見到 BDNF 的表達。原位雜交和逆行標記的結果也顯示，孵化后 30～35 天，BDNF mRNA 的表達僅限于雄鳥 HVC，且有 35%的 HVCRA投射神經元表達 BDNF mRNA。繼 HVC 之后，RA、X 區和 LMAN 于孵化后 65 天出現 BDNF 表達，直至成年期后，各區 BDNF 表達量急劇降低。
雖然上述研究結果存在一定差異\\(可能和當時的標記識別技術有關\\)，但仍可以推斷，BDNF 的表達與鳴唱控制系統發育及鳴唱行為密切相關 \\(圖 2\\)，且 HVC 可能是鳴唱控制系統中 BDNF 的主要來源，RA 中的 BDNF 可通過 HVC 順行軸漿運輸獲得，而 LMAN 和 X區也可通過順行或逆行運輸的方式相繼獲得 BDNF。
BDNF受體 trkB 在鳴唱控制系統內的表達分布原肌球蛋白受體激酶B\\(tropomyosin receptor kinase B，trkB\\)是BDNF 的高親和力受體，介導了BDNF 在神經系統中的作用。研究顯示，trkB mRNA 在孵化后 30～35 天的兩性斑胸草雀幼鳥RA、HVC 和 LMAN 中均有表達，但雄性幼鳥腦中 trkB mRNA 的表達量顯著高于雌性幼鳥，且此時HVCRA投射神經元只有極少數表達trkB mRNA，而45%～62%的LMANRA投射神經元表達trkB mRNA。
另外，在孵化后第六天\\(鳴唱控制系統正處于性別分化過程\\)，HVC中trkB mRNA的表達量明顯高于周邊其它腦區。Wade對兩性斑胸草雀幼鳥發育期\\(孵化后第3、15、30、45和60天\\)trkB的表達情況進行了詳細研究。實驗結果顯示，trkB免疫陽性細胞出現在發育期HVC和RA中。HVC中trkB標記最明顯，胞體和纖維均有標記。
雄鳥HVC在孵化后30～60天出現trkB標記，而雌鳥HVC在孵化后45～60天出現trkB標記。雖然雄鳥和雌鳥HVC在發育期的胞體標記密度大致相當，但由于雄鳥HVC體積在孵化后60天約為雌鳥的六倍，因此，雄鳥HVC中trkB免疫陽性細胞數遠多于雌鳥。在孵化后30～60天，雄鳥RA胞體和纖維出現trkB標記，而雌鳥RA中未見標記。以上結果表明，BDNF受體trkB在鳥類前腦HVC-RA通路中的表達具有明顯的性別二態性。BDNF與性激素在鳴唱行為調控中的相互作用。
在鳴唱行為只限于雄性的鳥類中，雄鳥鳴唱控制系統的發育遠比雌鳥完善，例如斑胸草雀、金絲雀 \\(canary\\) 等，雄鳥 HVC 和 RA 在核團體積、細胞數量及胞體面積上均大于雌鳥。雄鳥 X 區和 LMAN 也更大更明顯，而雌鳥 X 區和 LMAN 則很難鑒別。在雌雄兩性均可鳴唱的鳥類，兩性鳴唱控制核團之間則不存在顯著差異。鳴唱控制系統及鳴唱行為的性別二態性受性激素水平調控。
性激素對幼鳥鳴唱控制系統發育、成鳥鳴唱控制系統可塑性及鳴曲的形成與維持均有重要作用，并可影響 HVC 中血管內皮細胞分裂和新生神經元募集。雄激素受體在鳴唱控制系統 HVC、RA、LMAN、X 區、nXIIts 以及鳴肌中均有表達，而雌激素受體僅表達于 HVC。研究表明，雄、雌激素均對鳴唱控制系統及鳴唱行為有重要影響，且 BDNF 參與了性激素對鳴唱控制系統及鳴唱行為的調控作用。
鳴禽成年后，不斷有新生神經元加入 HVC，且這些新生神經元大多為 HVCRA投射神經元以往研究表明，HVC 中新生神經元的存活，受雄激素睪酮及其代謝物雙氫睪酮和雌二醇水平的影響，并與 BDNF 的作用有關。Rasika等通過對金絲雀的研究發現，在睪酮作用下，成年雌鳥 HVC 中 BDNF 的蛋白表達量提升。成年雌鳥經睪酮處理，或在 HVC 中注入 BDNF，均可使其中的新生神經元數量顯著增加。由睪酮誘導的新生神經元增加，可被 BDNF 中和抗體阻斷。因此，雄激素對 HVC 的作用很可能通過 BDNF 介導。另有實驗表明，成年雄性金絲雀鳴唱組HVC中BDNF mRNA的表達量增加了200%，蛋白表達量增加了30% \\(與非鳴唱組相比\\)。這種鳴唱相關的BDNF 表達，主要發生在 HVCRA投射神經元，并與單位時間的鳴唱數量成正比。
對新生神經元標記的結果表明，鳴唱組HVC內新生神經元的存活數量明顯高于非鳴唱組[16]。據此推測，由雄激素或鳴唱行為引起的 BDNF 表達量提升，對促進HVC內新生神經元的存活和HVC-RA通路突觸的形成具有重要作用。
已有研究表明，成年雌性金絲雀經睪酮處理后，可在兩周內引起HVC 中血管內皮生長因子\\(vascular endothelial growth factor，VEGF\\)及其血管內皮細胞受體VEGF-R2/Quek1/KDR 的表達上調，并最終使雌鳥的鳴唱行為、HVC 體積、HVC 神經元總數及其中新生神經元數量顯著增加[18]。VEGF 及其受體的表達上調可促進血管內皮細胞分裂。實驗結果顯示，經睪酮處理后第三周，HVC中BDNF的表達量增加，此發生在VEGF及其受體表達上調的一周后。
原位雜交的結果顯示，眾多BDNF mRNA的表達出現于血管內皮細胞。在體注射VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑，可充分減少HVC中血管內皮細胞的形成和新生神經元的數量。此外，如在埋植睪酮的同時注射 VEGF 受體酪氨酸激酶抑制劑，可充分抑制由睪酮引起的雌鳥鳴唱行為和新生神經元募集，但對HVC體積和神經元總數沒有影響。
通過質粒轉染增加HVC中BDNF的表達，可逆轉VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑的作用，即增加新生神經元數量，并最終發展形成類似雄鳥的鳴唱行為。因此推測，雄激素可誘導成年鳥腦HVC中VEGF及其受體的表達上調，進而通過VEGF介導血管內皮細胞的分裂并產生BDNF，最終引起新生神經元募集。
雌二醇作為睪酮經芳香化作用的產物，在鳴唱控制系統可塑性和鳴唱行為調控中起重要作用。Fusani 等研究發現，通過施加芳香酶抑制劑fadrozole 阻斷雄激素向雌激素轉化，可改變睪酮誘導的成年雌性金絲雀鳴唱行為，并抑制 HVC 中 BDNF 的表達。在雌性斑胸草雀孵化后第三天，如經皮下埋植 17β- 雌二醇，HVC 和 RA 中 BDNF 的表達量顯著提升 \\(孵化后第 25 天檢測\\)，即出現 BDNF 表達的雄性化特征。而雄性幼鳥在孵化 15 天后經 17β-雌二醇處理，可在 24 小時內誘導 HVC 內 BDNF mRNA 的表達，但對 RA 和 LMAN 無效。
對孵化后 30～35 天的雄性幼鳥施加芳香酶抑制劑，則可充分抑制 HVC 中 BDNF mRNA 的表達。由此推斷，雌激素對 HVC 中 BDNF 的表達起重要的調控作用，并進而影響 HVC投射核團的發育分化。
BDNF在鳴唱控制系統季節可塑性中的作用在季節性繁殖鳴禽中，鳴唱控制系統在形態學上具有明顯的季節可塑性。這種可塑性與神經組織的退變有關，并受血漿雄激素調節。在繁殖季中，日照周期變長對鳥類的生理功能有顯著影響。在長日照和血漿雄激素濃度升高的影響下，鳴唱控制核團體積增大，并伴隨鳴唱行為增加。
Wissman等對成年雄性白冠雀\\(white-crowned sparrow\\)的研究結果表明，在人工模擬繁殖條件下\\(皮下埋植睪酮并增加光照時間\\)，HVC 中 BDNF mRNA 的表達水平提高；RA 中 BDNF mRNA 的表達不顯著，且未受實驗模擬繁殖條件的影響。進一步研究顯示，如在 RA 內灌注 BDNF，可顯著引起其內神經元胞體面積和密度出現繁殖季樣變化。該結果提示，RA 季節性變化是由 HVC 中合成的 BDNF 蛋白通過順行軸漿運輸至其內所引起的。
成年雄性金絲雀HVC 中，每日都有新生神經元加入，以取代死亡的神經元。HVC 中新生神經元由側腦室室管膜放射狀細胞分裂產生。新生神經元在側腦室壁形成后，遷移至HVC，其中只有一部分新生神經元能存活下來，并接受突觸傳入，最終在結構和功能上整合入HVC。
在一年當中，不同時間段產生新生神經元的存活時間不同。Alvarez-Borda等分別對成年雄性金絲雀五月份\\(春季\\)和十月份\\(秋季\\)兩季的新生神經元進行[3H]胸腺嘧啶標記。標記后 30 天的結果顯示，秋季新生神經元的存活率比春季高兩倍，且秋季的標記細胞可存活八個月以上。春季新生神經元則持續死亡，至八個月后已所剩無幾。在注射[3H]胸腺嘧啶后 14～20 日，如連續在 HVC 中灌注 BDNF，可使春季新生神經元的存活率提升至正常秋季新生神經元的水平。
若在注射[3H]胸腺嘧啶后4～10或24～30日進行BDNF灌注，則不能獲得該效果。新生神經元形成后14～20日，恰逢其結束遷徙到達HVC內指定位點之時。由此推測，BDNF對新生神經元的作用可能存在敏感期。金絲雀在春季和秋季之后，均經歷血睪酮含量和鳴唱數量顯著下降的生理狀態。
顯然，BDNF可幫助新生神經元在敏感期內克服睪酮含量的不足，促進其長時間存活。BDNF在鳴曲形成過程中的作用斑胸草雀幼鳥在感覺運動期通過聽覺反饋進行鳴唱學習，且鳴曲需在幼年特定的時期\\(敏感期\\)內習得。幼鳥通過模仿親鳥的教習曲，并在不斷嘗試和練習之后，最終使自身鳴曲與教習曲達到一致。
在鳴唱學習過程中，鳴曲的結構由高度變化到逐漸固化。從感覺運動期結束\\(約在孵化后 90 天\\) 至整個成年期，鳴曲結構固化不變。一首鳴曲通常由若干序幕音和主題曲\\(motif\\)構成，其中，序幕音由一串重復的相同音節組成，而 motif 則由一系列不同的音節有序排列而成。一般每個 motif 包含 2～8 個音節。
VMP對鳴曲可變性的調控在幼鳥鳴曲學習和成鳥鳴曲維持中起重要作用。在 VMP 中，HVC 控制著鳴曲的音節順序和時間模式，并通過軸突依次激活 RA 內的神經元群，將音節順序指令傳達至 RA。RA則在接受 HVC 的指令后，對每個音節的結構特征進行調控，并最終產生并輸出一系列信號至腦干發聲控制區。研究證實，HVC 中神經元至少包含HVCRA投射神經元、HVCX投射神經元和中間神經元三種類型，其中兩類投射神經元的脈沖發放與音節順序有嚴格的時間對應關系[27]。RA 中神經元接受來自 HVCRA投射神經元的興奮性傳入。在抑制性中間神經元的調控下，相互聯系的投射神經元群可產生同步化發放。
RA內神經元發放模式的變化與鳴曲中音節的音調、振幅等聲學特征變化顯著相關。RA還通過 LMAN 與 AFP 相聯系。LMAN 的突觸傳入對 RA 活動具有重要影響。研究表明，電損毀斑胸草雀幼鳥 LMAN 后，將 BDNF 通過壓力直接注入 RA 內，可抑制因去除 LMAN突觸傳入所引起的 RA 內細胞凋亡。因此提示，BDNF 在 HVC-RA 和 LMAN-RA 通路對鳴唱行為的調控中起重要作用。
在鳴唱學習的感覺運動期，鳴禽幼鳥的鳴曲常常不能與教習曲達到完美匹配。
Dittrich 等將載有BDNF 基因的質粒，分別轉染至幼年雄性斑胸草雀 HVC、RA 和 X 區內表達。結果顯示，HVC 中 BDNF mRNA 表達量的短暫提升，可顯著提高幼鳥鳴曲與教習曲的匹配度，促進鳴曲習得。如將 BDNF 轉染于 RA 或 X 區，則未能獲得類似效果。該研究表明，在鳴唱學習的感覺運動期，HVC 內 BDNF 的表達可能對鳴曲形成起促進作用。
經研究發現，在鳴曲結構已固化的成年斑胸草雀RA 內注入 BDNF 包被的熒光膠乳微球，可使已高度穩定的鳴曲序列發生可逆性改變。實驗表明，注入BDNF后的1～7天，雖然鳴曲中音節的順序未變，但其中部分音節的呈現時有時無，鳴曲結構高度變化。
這種由外源性BDNF 引起的成鳥鳴曲結構變化，與正常處于感覺運動中期的幼鳥鳴曲結構高度相似。據此推測，正常成年斑胸草雀 RA 中，內源性 BDNF 的表達應處于較低水平，以此保證鳴曲結構的高度穩定。由 BDNF 引起的去穩定化的鳴曲結構，在一周后重新固化，但重新固化的鳴曲音節數量減少，原有的一個或多個音節被刪除，且刪除音節與相鄰音節之間的時間間隔縮短，表明鳴曲結構的改變并非只是音節丟失，還應包括對音節丟失后間隔時間的重新調整。如前所述，音節序列的時間模式應由 HVC 控制。因此，RA 內外源性引入BDNF對成鳥鳴唱行為的影響，應不僅僅局限于RA核團內部，很可能通過逆向軸漿運輸，同時對HVC產生作用。
形態學的實驗結果證實，BDNF注入后，伴隨著鳴曲結構的改變，HVC-RA通路突觸數量顯著增加，為上述假設提供了有力支持。根據以上實驗結果，我們推測在感覺運動期內，幼鳥RA內BDNF的高水平表達，對發育過程中HVC-RA通路突觸形成和鳴唱學習具有重要促進作用。
外源性BDNF可能通過增加HVC-RA通路突觸數量和/或突觸傳遞效能而引起鳴曲結構改變。鳴曲結構的改變和突觸數量的增加，必然伴隨HVC-RA通路電生理特性的變化。這種電生理特性的變化可能是BDNF參與HVC-RA通路對鳴唱行為調控作用的重要機制，對此還有待深入探索\\(圖3為我們提出的科學假設\\)。
展 望
綜上所述，BDNF 在鳥類鳴唱學習和鳴曲維持過程中起關鍵作用，尤其在發聲運動HVC-RA 通路對鳴唱行為的調控中扮演重要角色。目前，國內外關于 BDNF 對鳥類鳴唱調控作用的研究主要集中在BDNF 影響新生神經元募集及存活、性激素及性別二態性、鳴唱控制系統季節可塑性和鳴唱行為等方面。雖然已經取得了一批重要的理論成果，但對很多科學問題仍有待進一步研究。借助神經電生理學、藥理學、生物化學與分子生物學等技術手段，我們可以更清楚地認識BDNF 與鳥類鳴唱行為的關系，同時可為我們認識神經活動與運動程序編碼及腦與行為的關系，乃至人類語言學習和某些神經系統疾病提供重要借鑒。
