與體循環不同，肺循環血流阻力低，血管壓力低，血管壁薄，可擴展性好，肝源性肺損傷可引起肺循環相應的組織結構改變。肝肺綜合癥是在肝病和／或門靜脈高壓的基礎上出現的肺血管擴張和肺小血管增生為特征，且與肝病相關的動脈血氧合作用異常而導致的一類綜合征，在肝硬化病人中的發生率在５％～３２％。近年來，肝肺綜合征發病過程中，肺動脈平滑肌細胞的異常增值和遷移是可能是形成肺微血管擴張和血管增生的一個重要機制。因此，肺動肺平滑肌細胞的分離、培養成為研究肺血管壁細胞生物學行為及血管增生性疾病發生發展中的重要手段。然而，目前成人肺動脈平滑肌細 胞 （ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ，ＰＡＳＭＣｓ）體外培養受制約的因素較多，很難獲得成功。本實驗旨在通過改良的組織塊法建立穩定的成人肺動脈平滑肌細胞體外培養的模型，為開展肝源性肺損傷相關的實驗奠定良好的基礎。茲將改良成人肺動脈平滑肌細胞分離、培養和鑒定的方法報道如下。
１材料和方法
１．１材料
胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美國）、青霉素和鏈霉素（ｓｉｇｍａ公司，美國）、高糖ＤＭＥＭ／Ｆ１２１：１培養基（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美國）、ＰＤＧＦ－ＢＢ（武漢博士徳）和０．２５％胰蛋白酶（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美國），ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（北京索萊寶公司）；ＳＭ－α－ａｃｔｉｎ和ｃａｌｐｏｎｉｎ單克隆抗體（Ａｂｃａｍ公司，英國），ＦＩＴＣ標記山羊抗兔ＩｇＧ和ＤＡＰＩ、抗熒光淬滅封片液（上海碧云天公司），生物安全操作柜、ＣＯ２細胞 培養箱、振 蕩器（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ公司，美國），低溫離心機（ｅｐｐｅｎ－ｄｏｒｆ公司，德國），電控恒溫水浴箱（天津市泰斯特有限公司產品），倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡ＢＸ５１（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本）。
１．２平滑肌細胞的分離與培養
征得患者同意后無菌條件下取良性病變肺葉切除手術中廢棄的肺葉用無菌生理鹽水清洗去除血污。用眼科鑷分離出細小肺動脈并撕去平滑肌外膜，眼科剪刀縱行剪開血管，內膜面朝上，輕輕刮去內膜組織。獲得干凈光滑的血管段，將剝離的血管中膜用眼科剪剪成約１ ｍｍ×１ ｍｍ大小的碎片。將組織塊貼附于培養瓶底，每次可以接種２～４瓶，并每瓶加入４～５ ｍＬ含２０％胎牛血清、１０μｇ／ＬＰＤＧＦ、１００Ｕ／ｍＬ青霉素及１００ｍｇ／ｍＬ鏈霉素的含高糖ＤＭＥＭ／Ｆ１２１∶１的培養基。
１．３傳代細胞的培養
當原代細胞長出并逐漸相互交融形成致密單層細胞時即可傳代培養。首先吸去培養液，用無菌ＰＢＳ溶液洗滌３次。加入０．１％胰蛋白酶覆蓋細胞表面消化，在倒置相差顯微鏡下觀察，約１ｍｉｎ后，可見大部分細胞收縮變形，邊緣分界清楚，此時翻轉培養瓶，加入含有１０％胎牛血清的培養液以終止胰蛋白酶，停止消化。用滴管輕輕吹打分散細胞制成細胞懸 液，取懸液 于 離 心 管 內８００ｒ／ｍｉｎ離 心５ｍｉｎ，去上清液后再加入１０％培養基，輕輕吹打分散細胞制成細胞懸液后，按１∶２瓶的比例，接種到新的培養瓶中進行培養，每天觀察細胞形態，據細胞生長情況，約３ｄ換液１次。
１．４平滑肌細胞形態觀察
在倒置相差顯微鏡下觀察平滑肌細胞生長狀況。
１．５平滑肌細胞鑒定
取第３代細胞生長接近單層蓋玻片，吸出培養液，依次加入４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ，０．１％Ｔｒｉ－ｔｏｎＸ－１００３０ｍｉｎ，３％Ｈ２Ｏ２１ｍＬ，３７℃ ３０ｍｉｎ，用一抗（α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ１∶１００、ｃａｌｐｏｎｉｎ１∶２００），３７℃孵箱過夜，再分別加入二抗（抗兔ＦＩＴＣ－ＩｇＧ１∶１００）３０ｍｉｎ和ＤＡＰＩ復染１５ｍｉｎ，每次加入試劑前后均用ＰＢＳ洗滌５ｍｉｎ×３次，滴加少量抗熒光淬滅試劑，封片，在熒光顯微鏡下觀察結果。用血管平滑肌細胞特異的α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ、ｃａｌｐｏｎｉｎ抗體進行免疫組織化學方法的染色，應用熒光顯微鏡下觀察每個視野中染色陽性的細胞占所有細胞的比例。
２結果
２．１肺動脈平滑肌細胞形態觀察結果
（１）原代培養平滑肌細胞：倒置相差顯微鏡下觀察，成人ＰＡＳＭＣｓ沿組織塊爬出時間為７～９ｄ，細胞呈長梭形，有突起并相互接觸。見圖１。細胞培養至第１３～１５天，開始進入對數生長期，并且組織塊之間的細胞呈現出典型的" 峰谷" 征象。見圖２。
（２）傳代培養平滑肌細胞：５例成人ＰＡＳＭＣｓ原代培養時間（２０±２）ｄ，細胞進入對數生長期時間均為傳代后２４ｈ。成人ＰＡＳＭＣｓ原代培養全部獲得成功。培養過程中未見內皮細胞、成纖維細胞或微生物污染。
２．２肺動脈平滑肌細胞應用免疫熒光組織化學染色進行鑒定。
結果免疫熒光組織化學染色后，抗α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ和ｃａｌｐｏｎｉｎ平滑肌肌動蛋白均可見胞質內肌絲被染成綠色，細胞核經ＤＡＰＩ染色后清晰可見，呈藍色，橢圓形，細胞平均陽性率≥９８％。見圖３、４。
３討論
肝肺綜合征主要以肺血管擴張和肺小血管增生為典型的病理改變，而肺血管平滑肌細胞是構成其血管壁的重要細胞成份，其體外培養是研究肝源性肺血管損傷及血管增生性疾病的重要手段。穩定細胞培養可使細胞在標準的，可控的條件下進行研究，但成人ＰＡＳＭＣ的體外培養很難成功。分離培養成人的肺動脈平滑肌細胞最能體現其病變的生物學特征。然而，目前國內外大多數實驗室仍主要選用兔、豬、鼠等較易培養的動物肺血管體外培養平滑肌細胞來建立研究模型，盡管動物的ＰＡＳＭＣ較容易培養，但其與人（尤其是成人）的肺血管平滑肌細胞在形態學及生物學特性方面存在很多的差異，由此而得出的實驗結果并不能準確模擬人體的肺血管的生物學特征。亦有少數采用人胎兒臍動脈，而很少采用培養成人細小肺動脈進行研究。成人的細?。校粒樱停弥耘囵B難度很高，其主要原因是組織內絕大多數成人ＰＡＳＭＣ處于休眠期，進入分裂期的細胞相對較少，而且成人ＰＡＳＭＣ繁殖力較弱，傳代不穩定，細胞經數次傳代易發生細胞“老化”，造成其體外培養成功率很低。
目前，原代培養ＰＡＳＭＣ的方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法，酶消化法培養周期雖短，但其操作復雜，酶作用時間不易掌握，且消化酶本身對細胞具有毒性作用，不易獲得穩定的細胞株。組織塊貼壁法雖然操作簡單，經濟實用，但同時具有原代細胞到達傳代時間較長，成功率不高，而且容易出現“去分化”。通常認為，成人肺動脈平滑肌細胞是高度分化的細胞，不易培養成功，經過反復摸索，我們建立了一種改良培養成人肺動脈平滑肌組織塊貼壁法。
血小板衍性生長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＰＤＧＦ）是公認的最強的有絲分裂的激活因子。在此改良方法中，加入的ＰＤＧＦ通過與細胞膜上的ＰＤＧＦ受體結合并隨之被激活，平滑肌細胞表型從正常的收縮型變成幼稚的合成型，促進平滑肌細胞的增殖和遷移。又因ＰＤＧＦ受體代謝非?？?，ＰＤＧＦ與其受體結合后形成復合物，此復合物迅速進入細胞內，且隨之降解。加上在無血清及ＰＤＧＦ的ＤＭＥＭ里同步化后，ＰＤＧＦ的作用即消失，所以對后期的試驗干預不產生影響。體外培養平滑肌細胞在高葡萄糖濃度（≥９ ｍｍｏｌ／Ｌ）時，ＰＤＧＦ受體表達增高，從而使血管平滑肌細胞遷移能力增強。因此，ＰＤＧＦ和高糖克服了成人血管平滑肌體外培養休眠期過長的缺點，從而縮短了培養周期，提高了培養的成功率。組織塊翻面的時間以１０～１４ｈ為宜，時間過長或者過短都會造成細胞死亡。一般７～９ｄ可觀察到細胞從組織邊緣呈放射狀長出，但５ｄ內不易移動，以免貼壁的組織塊脫落，而脫落的組織塊很難有細胞長出。傳代的過程中，以０．１％胰蛋白酶濃度為宜，在室溫２０～２５℃條件下，最佳的酶消化時間為６０～８０ｓ，在該濃度及消化時間下剛好能使成人ＰＡＳＭＣ從瓶壁上消化下來，即可起到去除成纖維細胞及純化平滑肌細胞的作用，又可不致細胞死亡。同時，培養細胞的鑒定多采用平滑肌細胞抗體α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ，但α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ特異性較差，除平滑肌細胞外，還可表達于成纖維細胞，肌上皮細胞，骨髓間質肝細胞等。鈣調蛋白ｃａｌｐｏｎｉｎ為平滑肌細胞特異性抗原，故本實驗選用α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ，ｃａｌｐｏｎｉｎ兩 種 抗 體 作 為 免 疫 熒 光 染色，結果９８％培養細胞呈陽性，說明說培養的細為平滑肌細胞，經過傳代，細胞可以純化。
總之，本實驗通過在高糖培養基中加入ＰＤＧＦ的改良方法，克服了成人ＰＡＳＭＣ具有生長緩慢、休眠期長的生物學特性，成功地能在３～４周內獲得能傳代的原代成人ＰＡＳＭＣ。運用此方法獲得穩定的成人原代ＰＡＳＭＣ，經過同步細胞純化，能夠較快建立起所需的實驗模型。該體外培養方法不但克服了ＰＡＳＭＣ培養困難的問題，且為肝源性肺血管性疾病及肺血管增生性疾病的研究提供了一條簡便、穩定新途徑；更重要的是，較動物或胎兒的體外培養血管平滑肌細胞模型所得的實驗結果，此改良建立的成人ＰＡＳＭＣ模型因更符合人體實際情況而更具有說服力。
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