ＢＨＫ－２１細胞（Ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌ）是從敘利亞幼鼠腎組織中分離培養獲得的成纖維型貼壁細胞系，該細胞常用于多種病毒的增殖和純化，如 口 蹄 疫 病 毒 （Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉ－ｒｕｓ，ＦＭＤＶ）、腦心肌炎病毒（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒ－ｄｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＥＭＣＶ）、呼腸孤病毒（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）和水皰性口炎病毒（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ）等，目前，該細胞廣泛應用于口蹄疫疫苗的規?；a。在疫苗生產過程中需要對細胞的培養條件進行不斷地優化來提高細胞密度和病毒產量，而細胞代謝動力學特征研究是細胞培養條件優化最重要的內容之一。該文通過對靜置培養條件下ＢＨＫ－２１細胞生長的葡萄糖（Ｇｌｕｃ）、乳酸（Ｌａｃ）、谷氨酰胺（Ｇｌｎ）和氨（ＮＨ４＋）的代謝進行測定和分析，建立了該細胞對Ｇｌｕｃ、Ｌａｃ、Ｇｌｎ和ＮＨ４＋等物質的代謝動力學模型，為該細胞高密度培養條件優化提供參考。
１材料與方法
１．１材料
ＤＭＥＭ培養基（Ｇｉｂｃｏ），新生牛血清（蘭州民海，使用時按培養液體積的１０％添加）和胰蛋白酶（Ｇｉｂｃｏ，使用濃度為０．２５％）等。所用細胞為ＢＨＫ－２１細胞，由甘肅省動物細胞工程技術研究中心提供。儀器設備為多參數生化分析儀（Ａｐ－ｐｌｉｔｅｃｈ，ＮＯＶＡ４００）、細胞計數儀（ＩＮＮＯＶＡＴＩＳ，ＣＡＳＹＴＴ）、二氧化碳培養箱（Ｔｈｅｒｍｏ，３１１１型）及倒置相差顯微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＣＫＸ４１型）等。
１．２方法
１．２．１細胞準備
常規法復蘇ＢＨＫ－２１細胞，顯微鏡觀察，待８０％以 上細胞貼壁后，換液 培養。細胞長成致密單層后按１∶４傳代培養，選用復蘇后培養第３、４、５代的細胞分別進行生長動力和代謝動力學試驗。
１．２．２細胞生長動力學及活力曲線繪制
（１）低密度細胞懸液制備：取復蘇后適應培養第３代的ＢＨＫ－２１細胞，用胰酶消化后制成細胞懸液，計數，按有 限 稀 釋 法 的 原 則，將 細 胞 懸 液 稀 釋 至１．０×１０４～２．０×１０４ｕｐｆ·ｍＬ－１。（２）接種及培養：將稀釋好的細胞懸液接種到２４個Ｔ２５的細胞瓶中，每瓶１０ｍＬ，置３７℃，５％ ＣＯ２中培養。（３）計數、活力檢查及樣品收集：從接種培養算起，每隔２４ｈ，?。称考毎麑⑸锨寤旌暇鶆?，?。常恚汤鋬隽魳樱ㄓ糜诩毎x試驗），然后分別消化計數，檢查細胞活力，直至細胞密度降低為止。（４）平行試驗：同法對第４、５代的細胞進行試驗，并計算各培養階段的細胞密度和活力的平均值及其標準偏差。（５）生長曲線繪制：以培養時間為橫坐標，平均細胞密度和細胞活力為縱坐標，繪制細胞的生長曲線和活力變化曲線。（６）計算細胞倍增時間：倍增時間＝Ｔ／Ａ（式中：Ａ＝ｌｏｇ２Ｙ／Ｘ，其中，Ｙ為細胞峰值前１ｄ計得的數，Ｘ為接種細胞數，Ｔ為培養時間）。
１．２．３代謝動力學模型
（１）樣品檢測：將收集的各培養階段的培養液樣品用多參數生化分析儀檢測Ｇｌｕｃ、Ｇｌｎ、Ｌａｃ和ＮＨ４＋的濃度，并計算３個代次 細 胞 各 培 養 階 段 的 平 均 值 及 其 標 準 偏差。（２）代謝曲線繪制：以培養時間為橫坐 標，Ｇｌｕｃ、Ｇｌｎ、Ｌａｃ和ＮＨ４＋濃度平均值為縱坐標繪圖，即得代謝曲線圖。（３）細胞指數：生長期比代謝速率計算求得其中，Ｘ１和Ｘ２是２個取樣點的細胞密度；ΔＳ是２個取樣點被測物濃度的變化值；Δｔ是子個取樣點的時間間隔。
２結果與分析
２．１細胞生長曲線
ＢＨＫ－２１細胞在靜置培養條件下生長曲線呈Ｓ型，前２４ｈ為適應期，２４～１２０ｈ為對數生長期，以后便進入平臺期和衰退期，平均最大增殖密度為５０．３×１０４ｕｐｆ·ｍＬ－１，倍增時間為２１．１ｈ，繪制細胞生長曲線圖如圖１所示。細胞活力在所繪制的生長曲線內保持較高水平，在培養后期開始下降。連續培養３個代次各階段的平均細胞密度和活力見表１。
ＢＨＫ－２１細胞在生長過程中要消耗Ｇｌｕｃ和Ｇｌｎ，同時代謝要產生廢物Ｌａｃ和ＮＨ４＋（見表２），在７２～９６ｈ內消耗Ｇｌｕｃ、Ｇｌｎ和生成Ｌａｃ、ＮＨ４＋的量最高，在整個對數生長期內Ｇｌｕｃ和Ｇｌｎ的比消耗速率為－３．７９ｍｇ·（１０６ｃｅｌｌｓ）－１·ｄ－１和－９．９５μｍｏｌ·（１０６ｃｅｌｌｓ）－１·ｄ－１，Ｌａｃ和ＮＨ４＋的比生 成 速 率 為２．８１ ｍｇ·（１０６ｃｅｌｌｓ）－１·ｄ－１和６．３０μｍｏｌ·（１０６ｃｅｌｌｓ）－１·ｄ－１（見表３）
葡萄糖和谷氨酰胺是細胞培養基中的主要碳源和能源。谷氨酰胺代謝能為動物細胞生長提供３０％～６５％的能量，大部分的葡萄糖通過糖酵解途徑為細胞提供中間代謝物質和能量，最終生成乳酸，只有很少部分進入三羧酸循環（ＴＣＡ）和磷酸戊糖途徑。谷氨酰胺是動物細胞培養中最重要的氨基酸，也是培養基中濃度最高的氨基酸。谷氨酰胺是細胞生物合成中氮的主要來源，核酸中的嘌呤、嘧啶和氨基糖中的氮來自谷氨酰胺。谷氨酰胺也可以作為碳源直接參與細胞大分子物質的合成。
谷氨酰胺的存在可以促進其它氨基酸的運輸和利用。在細胞培養中，谷氨酰胺不穩定，容易降解。細胞也會過量利用谷氨酰胺，導致氨的積累?？刂婆囵B基中谷氨酰胺的濃度，可以有效降低氨的積累，改善細胞的生長環境。乳酸是在培養過程中動物細胞代謝葡萄糖產生的主要代謝產物之一，對細胞的生長、代謝和產物的合成有著重要的影響。乳酸主要來源于葡萄糖的代謝過程，谷氨酰胺及其它氨基酸的代謝也能產生少量乳酸（此部分乳酸約占乳酸總量的１０％左右）。在有氧的條件下，依細胞類型和培養條件的不同，葡萄糖轉變成乳酸的量在５％～１０％，最大可達７０％。乳酸對細胞生長的不良影響主要是改變培養環境的ｐＨ和滲透壓，間接地影響細胞的生長、代謝和產物的合成。盡管不同的細胞系對乳酸具有不同的耐受能力，但只要維持ｐＨ恒定，一般均能耐受較高濃度的乳酸。在ｐＨ恒定的情況下，乳酸對細胞生長的影響可能來自２個方面，一是乳酸本身對細胞生理生化的影響；二是因乳酸的添加而導致了培養基滲透壓的增加，繼而影響細胞生長。
氨主要是由谷氨酰胺等氨基酸脫氨產生的。細胞培養過程中，谷氨酰胺的消耗比其它氨基酸的總和還多，８０％～９０％的氨都是由谷氨酰胺代謝產生的。與乳酸相比，較低濃度的氨就會對細胞生長產生抑制。氨的積累使細胞內的ＵＤＰ氨基己糖增加，影響細胞的生長及蛋白質的糖基化過程。氨抑制谷氨酰胺代謝途徑，使天冬氨酸和谷氨酸的消耗增加，影響細胞的氨基酸代謝。同時氨濃度的提高改變 了 細胞內 局 部微環境的ｐＨ，影響細胞的正常生理功能。氨不僅對細胞的生長具有較強的抑制作用，而且對細胞的生存也具有毒性。當氨的濃度高于３ｍｍｏｌ·Ｌ－１時，對細胞的生長具有明顯的抑制作用。
該研究建立了ＢＨＫ－２１細胞生長及代謝動力學模型，為ＢＨＫ－２１細胞應用于口蹄疫疫苗的生產提供了基本理論依據。
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