姬松茸\\(AgaricusBlazeiMurill\\)為蘑菇科蘑菇屬真菌,富含蛋白質和糖類。姬松茸多糖是從姬松茸子實體中提取的有效活性成分,具有螺旋狀的三維立體結構,是一種β型的葡聚糖。據相關研究報道:姬松茸多糖具有降血糖、提高免疫力、抗病毒和抗腫瘤等作用。關于姬松茸多糖提高腦老化小鼠學習記憶能力的作用及其機制的研究國內外尚未見報道。

D-半乳糖\\(D-gal\\)致動物衰老模型由徐黻本首次提出,在國內已被廣泛應用。許多學者在大鼠和小鼠上都證實該模型表現出幾種與人類自然衰老相類似的機能改變,包括出現腦老化。

本研究以頸背部皮下注射D-gal制備腦老化小鼠模型,采用水迷宮、避暗儀、流式細胞術等實驗方法,觀察姬松茸粗多糖對D-gal致腦老化模型小鼠行為學、海馬神經細胞線粒體膜電位及凋亡的影響,探討其提高腦老化小鼠學習記憶能力的作用及可能機制,為更好地開發利用姬松茸資源提供實驗依據。

1、材料與方法

1.1動物

雄性昆明種小鼠40只,體質量20~25g,由廣東省醫學實驗動物中心提供,生產許可證號:SCXK\\(粵\\)2008-0002。

1.2藥品制備

姬松茸粗多糖由本研究組自制:取姬松茸原菌體1000g,加約5倍蒸餾水浸泡12h,文火煮沸1h,收集煎液,再加等體積的蒸餾水文火煮沸30min,收集煎液。合并2次煎液,靜置12h,過濾,濃縮至一定體積后,加入80%的乙醇沉淀12h,離心,收集醇沉物。醇沉物于恒溫干燥箱\\(75℃~80℃\\)至相對干燥,獲得姬松茸多糖粗制品,每克浸膏相當于生藥3.0g。

1.3主要試劑與儀器AnnexinV-FITC&PI試

劑盒為美國Pharmingen公司產品,JC-1試劑盒為美國CellTechnology\\(細胞工程\\)公司產品;Morris水迷宮\\(中國醫學科學院藥物研究所,型號:DMS-2\\),小鼠避暗儀\\(成都泰盟公司,型號:BA-200\\),流式細胞分析儀\\(美國貝克曼庫爾特公司,型號:FC500\\)。

1.4動物模型制備與分組

小鼠隨機分為4組,每組10只:正常組,D-gal腦老化模型組,姬松茸粗多糖低、高劑量組。除正常組小鼠頸背部皮下注射生理鹽水外,其他各組小鼠頸背部皮下注射D-gal120mg·kg-1,每天1次,連續42d,制備小鼠亞衰老模型。在制備動物模型的同時,正常組和模型組小鼠灌胃生理鹽水,姬松茸粗多糖低、高劑量組小鼠分別灌胃姬松茸粗多糖60和120mg·kg-1,每天1次。

42d后進行行為學、海馬神經細胞線粒體膜電位及凋亡的檢測。行為學檢測期間正常飼養小鼠。

1.5空間探索測試

測試設備為Morris水迷宮。迷宮水池壁上標明4個等距離點,等分成4個象限。在位于池壁和圓心中間的第4象限放置一平臺,平臺沒于水下1cm,水中倒入牛奶,使小鼠視覺無法辨別平臺。設定平臺為中心,中心區域為半徑5cm環內,中環為向外25cm內,外環為再向外40cm。通過迷宮上方與計算機相連接攝像機全程跟蹤小鼠活動軌跡。實驗在安靜環境進行,水池水溫\\(25.0±1.0\\)℃。正式測試前先對各組小鼠進行適應性訓練:從水迷宮池壁第2象限\\(遠離目標象限\\)處放下小鼠,記錄小鼠從入水到爬上平臺所需的時間。如果小鼠在3min內未找到平臺,由實驗者將其引導至平臺,待小鼠爬上平臺并停留20s。每天訓練1次,連續5d。第6天撤去平臺,隨機選下水點進行正式測試,以3min內小鼠分別在中心區、中環、外環的游泳距離占總距離的百分比及第4象限\\(目標象限\\)游泳路程表示小鼠學習記憶能力。

1.6被動回避測試

避暗儀由明暗兩室組成,大小相同,底部為不銹鋼柵。明室上方裝置15W日光燈一只,暗室通36V電壓。首先進行記憶獲得性訓練:將小鼠放入明室,因天生具有嗜暗習性,小鼠鉆入暗箱即遭受電擊,迅速逃離暗室,從而獲得暗箱遭受電擊記憶,為期1d。

24h后,將小鼠放入明室,記錄300s內小鼠放入明室到進入暗室的時間\\(潛伏期\\)和進入暗室的次數\\(錯誤次數\\),以此表示小鼠的學習記憶能力。

1.7海馬神經細胞線粒體膜電位測定

小鼠頸椎脫臼處死,迅速取出全腦,冰盤上分離海馬,投入液氮冷凍后取出,放入冰箱\\(-80℃\\)保存備用。

檢測時,海馬置于盛生理鹽水的培養皿,用2張處理潔凈的載玻片輕研組織至勻漿狀,過300目篩網制備成單細胞懸液,懸液于室溫下5000r·min-1離心2min,棄上清,加入10mg·L-1的JC-1,避光靜置15min后,以激發波長488nm行流式細胞分析。采用CellQuest數據處理軟件,獲取1×104個細胞。以測量JC-1的熒光強度\\(反映線粒體膜電位的高低\\)來了解小鼠海馬神經細胞線粒體膜電位的變化。

1.8海馬神經細胞凋亡檢測

制備單細胞懸液\\(方法同1.7\\),冰預PBS洗細胞2次,以1×結合緩沖液重懸細胞,并調整細胞濃度至1×106mL-1,取細胞懸液100μL至5mL管,再加入Annexin-V-FITC5μL、PI10μL,混勻。于避光室溫下孵育15min,然后每管加入1×結合緩沖液400μL,1h內激發波長488nm行流式細胞分析。計數1×104個細胞,所有資料均經CellQust軟件收集處理,以細胞凋亡百分率表示小鼠海馬神經細胞凋亡情況。

1.9統計學分析

采用SPSS14.0軟件包進行統計分析,各組小鼠空間探索測試指標、潛伏期、錯誤次數、線粒體膜電位和細胞凋亡百分率以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析。

2、結果

2.1各組小鼠空間探索測試結果

與正常組比較,模型組小鼠在外環區域的游泳距離占總游泳距離百分比顯著增多\\(P<0.01\\),中環和中心區域的游泳距離占總游泳距離百分比顯著減少\\(P<0.01\\),第4象限游泳路程顯著減少\\(P<0.01\\)。與模型組比較,姬松茸粗多糖組小鼠中心區域游泳距離占其總距離百分比明顯提高\\(P<0.05或P<0.01\\),第4象限游泳路程明顯增多\\(P<0.05\\)。姬松茸粗多糖高、低劑量組間比較差異無統計學意義\\(P>0.05\\)。見表1。

2.2各組小鼠被動回避測試結果

與正常組比較,模型組小鼠的逃避電擊潛伏期顯著縮短\\(P<0.01\\),錯誤次數顯著增多\\(P<0.01\\)。與模型組比較,姬松茸粗多糖組小鼠潛伏期明顯延長\\(P<0.05\\),錯誤次數明顯減少\\(P<0.01\\)。姬松茸粗多糖高、低劑量組間比較差異無統計學意義\\(P>0.05\\)。見表2。

2.3各組小鼠海馬神經細胞線粒體膜電位和細胞凋亡率

與正常組比較,模型組小鼠海馬神經細胞線粒體膜電位顯著下降\\(P<0.01\\),細胞凋亡率顯著提高\\(P<0.01\\);與模型組比較,姬松茸粗多糖組小鼠線粒體膜電位顯著升高\\(P<0.01\\),細胞凋亡率明顯下降\\(P<0.05或P<0.01\\)。姬松茸粗多糖高、低劑量組間比較差異無統計學意義\\(P>0.05\\)。見表3。

3、討論

本研究分別采用Morris水迷宮和避暗儀測試小鼠的學習記憶能力:以小鼠分別在水迷宮中心區、中環、外環的游泳距離占總游泳距離的百分比和第4象限游泳路程作為參數,記錄小鼠的探索平臺的過程,其關鍵在于小鼠在圍繞平臺的中心區域時間和路程;以被動回避法記錄小鼠自放入明室到進入暗室的時間和進入暗室的次數,凡300s仍不進入暗室者,反映記憶功能良好。本研究結果顯示:與正常組比較,模型組小鼠在外環區的游泳距離占其總距離百分比顯著增多,中環和中心區域的游泳距離占總游泳距離的百分比顯著減少,第4象限游泳路程明顯減少,躲避電擊潛伏期顯著縮短,進入暗箱的錯誤次數顯著增多,提示D-gal致衰小鼠出現明顯的記憶鞏固和再現障礙等腦老化跡象;給予姬松茸粗多糖后,衰老小鼠在中心區域游泳距離占其總距離百分比明顯提高,衰老小鼠在第四象限游泳路程增加,躲避電擊潛伏期明顯延長,進入暗箱的錯誤次數明顯減少,提示姬松茸粗多糖可提高衰老小鼠學習記憶和回避遭受電擊的能力,發揮延緩腦老化進程的作用。

線粒體是真核細胞中由雙層高度特化的單位膜圍成的細胞器,其主要功能是通過氧化磷酸化作用合成ATP,為細胞各種生理活動提供能量。線粒體由兩層膜包被,外膜平滑,內膜向內折疊形成嵴。線粒體中央由內膜包繞為內室,兩層膜之間為外室。內膜存在有質子泵,質子泵將質子從內室泵出,進入外室,從而形成內室為負、外室為正的橫跨線粒體內膜的線粒體膜電位,該電位對維持線粒體正常功能極為重要。近年來,有關研究逐漸認識到線粒體可能是調控細胞凋亡的中心。有研究報道:在多種誘導因素下均觀察到線粒體膜電位的下降,如:腫瘤壞死因子、化療藥物、糖皮質激素等誘導的細胞凋亡過程中。線粒體膜電位的降低是細胞發生凋亡早期的一個不可逆變化。

穩定線粒體膜電位成為抑制細胞凋亡的重要機制之一。本研究采用流式細胞技術觀察姬松茸粗多糖對腦老化小鼠海馬神經細胞線粒體膜電位及凋亡發生率的影響,結果顯示:與正常組比較,模型組小鼠海馬神經細胞線粒體膜電位顯著下降,細胞凋亡率顯著提高,提示D-gal致衰老小鼠海馬神經細胞存在線粒體膜電位的異常,可能是小鼠海馬神經細胞發生凋亡的早期原因之一;給予姬松茸粗多糖后,小鼠海馬神經細胞線粒體膜電位則顯著升高,細胞凋亡率則明顯下降,提示姬松茸粗多糖可提高衰老小鼠海馬神經細胞線粒體膜電位,抑制海馬神經細胞凋亡,發揮神經細胞保護作用,該作用與姬松茸粗多糖改善小鼠學習記憶能力有關。