誘導性多能干細胞 （ induced pluripotent stemcells,iPSC） 是利用基因工程技術將動物或人的體細胞重編程而得到的一種類似胚胎干細胞（embryonicstem cells,ESC）的多能干細胞類型[1].本研究小組前期研究發現，維甲酸能誘導 iPSC 分化成神經細胞，并且能形成功能性的神經元。但在體內特定微環境下，iPSC 是否可以有效分化為不同類型的神經元和膠質細胞還不清楚?；铙w內環境更為復雜，目前還沒有 iPSC 移植治療的成功案例，iPSC 能否在周圍細胞和信號分子的作用下發生定向分化以及移植體內的細胞能否正常存活，尚不明確。
為明確 iPSC 在體內特定微環境誘導下定向分化的能力，本研究利用小鼠的腦組織勻漿上清與小鼠iPSC 共培養、小鼠海馬腦片與小鼠 iPSC 共培養兩種技術來模擬腦內微環境，同時與目前公認的比較成熟的化學誘導劑全反式維甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）的誘導效果相比較，研究特定微環境誘導 iPSC向神經元樣細胞分化的能力。本研究將為后續 iPSC用于臨床上神經損傷的治療提供新的思路和方法，對再生醫學的發展有一定意義。
1 材料和方法
1. 1 材料
小鼠 iPSC 購于中科院廣州生物醫藥與健康研究院；MEM、knockout DMEM、神經元基礎培養基 KSR、L-谷氨酰胺的衍生物 GlutaMAXTM、非必需氨基酸 （ nonessential aminoacid,NEAA）、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）、B27、重組小鼠白血病抑制因子 （ recombinant mouse leukemia inhibitoryfactor,rmLIF）均購自 Gibco 公司； ATRA 購自 Sigma 公司； 馬血清（horse serum,HS）、胎牛血清（fatal bovine serum,FBS）購自 HyClone 公司； RIPA 裂解液、ECL 發光試劑盒、HRP 標記的山羊抗兔 IgG 及 HRP 標記的山羊抗小鼠 IgG 均購自碧云天生物技術公司； 小鼠抗 GAPDH 單克隆抗體（monocalonalantibody,mAb） 、兔抗 nestin 多克隆抗體、兔抗膠質纖維酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein,GFAP）多克隆抗體、小鼠抗微管相關蛋白 2（microtubule-associated protein 2,MAP2）mAb 購自 Abcam 公司； Alexa Fluor\ue4d1568 標記的山羊抗小鼠IgG、Alexa Flour \ue4d1488 標記的山羊抗兔 IgG 購自 Moleularprobes 公司。CO2培養箱為 Thermo 公司產品。
1. 2 方法
1. 2. 1 iPSC 的培養與處理 復蘇小鼠 iPSC,并接種于經絲裂霉素 C 處理的小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上，加入iPSC 培養基（ knockout DMEM、 KSR、 100 × GlutaMAX、10 mmol / L NEAA、10 mmol / L β-mercaptoethanol、100 μg / LrmLIF）； 37℃ 、50 mL / L CO2培養箱中培養。待 iPSC 克隆長滿飼養層（一般為 6 ~8 d），用 1 g/L 的胰蛋白酶消化成單細胞； 將此 iPSC 與飼養層細胞混懸液轉移至新的培養皿中，差速貼壁 30 min,以去除剩余的飼養層細胞，獲得富集的 iPSC.
1. 2. 2 ATRA 誘導實驗 取 5 × 105/ mL 并清除飼養層細胞后的 iPSC,放置于低黏附的玻璃培養皿中懸浮培養。將不含rmLIF 的 iPSC 培養基作為該細胞的培養基，每天取出3 ~ 5 次，輕輕振蕩使細胞團分開； 每 2 d 半量換液，每天觀察擬胚體（embryoid body,EB）形成的情況。EB 懸浮培養 4 d后，在原培養基中加入 ATRA （ 在培養基中的終濃度為5 × 10- 7mol / L） 繼續培養 3 ~ 4 d; 隨后轉入 1 g / L 明膠包被的 6 孔板中貼壁培養，培養基為不含 ATRA 的神經元基礎培養 基 （ neurobasal medium、 50 × B27、 100 × GlutaMAX、100 IU / mL 青霉素、100 μg / mL 鏈霉素），并在培養基中加入20 ng / mL 的堿性成纖維細胞生長因子（ basic fibroblast growthfactor,bFGF） 及 20 ng / mL 的表皮生長因子（ epidermal growthfactor,EGF）（100μL/孔）。每天觀察其形態變化。
1. 2. 3 腦片微環境誘導 iPSC 向功能性神經元分化實驗按文獻[2]的方法進行腦片培養。簡述如下： 將 C57BL/6小鼠（P7）浸入 750 mL/L 乙醇中消毒、斷頭取腦，在預冷的Hank 平衡鹽溶液中迅速剝離海馬。將其水平置于 McIlwainTM自動切片機載物臺上，切取 350 μm 厚海馬切片； 隨后將切片轉移至含培養膜（0. 14 μm）6 孔板進行培養。在馬血清營養培養液（250 mL/L 馬血清、250 mL/L Hank's 液、500 mL/LMEM、2 mmol / L 谷氨酰胺） 條件下培養，每 3 d 換 1 次培養液。腦片培養 1 ~ 2 d,在培養的海馬腦片上滴加已形成EB 的 iPSC 懸液，進行腦片-細胞共培養。觀察在海馬腦片微環境的誘導下，iPSC 的分化情況。
1. 2. 4 腦勻漿上清對小鼠 iPSC 向神經元樣細胞分化的誘導實驗 小鼠腦組織勻漿上清的提?。?8 周齡小鼠斷頭取出腦組織，置于冰上，稱取濕重，按 150 mg/mL 加入預冷的 knockoutDMEM 培養基，用勻漿器將腦組織勻漿，離心后吸取上清液，微孔濾膜過濾除菌后儲存于 -20℃冰箱中備用； 將 iPSC 形成EB,隨后加入腦勻漿上清 100 μL/mL,細胞繼續培養3 ~4 d,隨后轉入1 g/L 膠包被的6 孔板中貼壁培養，培養基為普通神經元培養基（neurobasal medium、50 × B27、100 × GlutaMAX、100 × P / S ）， 并在培養基中加入 20 ng / mL 的 bFGF 及20 ng / mL 的 EGF（100μL/每孔）。每天觀察其形態變化。
